研究论文

应用HCR-FISH技术研究冷泉沉积物中甲烷厌氧氧化古菌的生存状态

  • 何茂雨 ,
  • 王景 ,
  • 李思翰 ,
  • 梁乐文 , *
展开
  • 上海交通大学 海洋学院,上海 200240
*梁乐文(1994—),男,博士后,主要从事海洋沉积物中微生物介导的甲烷转化过程方面的研究, E-mail:

何茂雨(1999—),女,山东省日照市人,主要从事海洋沉积物环境中的微生物方面的研究,E-mail:

收稿日期: 2024-03-22

  修回日期: 2024-04-28

  网络出版日期: 2025-05-30

基金资助

国家自然科学基金(42406089)

中国博士后科学基金资助项目(2023M732206)

国家资助博士后研究人员计划(GZB20230406)

Utilizing HCR-FISH to investigate the status of anaerobic methanotrophic archaea in cold seep sediments

  • HE Maoyu ,
  • WANG Jing ,
  • LI Sihan ,
  • LIANG Lewen , *
Expand
  • School of Oceanography, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Received date: 2024-03-22

  Revised date: 2024-04-28

  Online published: 2025-05-30

摘要

甲烷厌氧氧化(anaerobic oxidation of methane,AOM)过程是冷泉沉积物中元素循环过程的重要一环。该反应一般由甲烷厌氧氧化古菌(anaerobic methanotrophic archaea,ANME)和硫酸盐还原细菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)共同完成,两者通常以共生体的方式存在。然而目前尚未获得ANME纯培养菌株,且其缓慢的代谢阻碍了对其代谢特征、协同作用机制的进一步探索和研究。本文通过杂交链反应-荧光原位杂交技术(hybridization chain reaction-fluorescence in situ hybridization,HCR-FISH)并结合16S rRNA基因高通量测序结果,调查了南海Formosa冷泉(简称F冷泉)黑色菌席区域不同深度沉积物中ANME群落组成情况及存在状态。结果显示,ANME-1和ANME-2为F冷泉沉积物中的主要ANME类群,其中,ANME-2和SRB以菌团聚集体的方式存在,而未发现ANME-1类群与细菌成团的情况。这表明ANME-2多与SRB共生进行AOM过程,并且暗示ANME-1与ANME-2存在不同的生理功能和甲烷代谢机制。另外,在所有层位的沉积物样品中,ANME-2/SRB菌团直径主要集中在3~10 μm之间。相关性分析表明,菌团直径分布与沉积物中硫酸盐浓度等环境因子显著相关,指示冷泉环境因子对ANME/SRB菌团生长的影响作用。此外,通过HCR-FISH技术进一步发现,在F冷泉沉积物中存在多个排列整齐、大小均匀的菌团连接形成的菌团簇,这种特殊结构暗示菌团间可能存在着联系或合作关系。本研究揭示了F冷泉不同深度沉积物中ANME类群的存在状态及共生菌团的大小和分布规律,为进一步揭示不同ANME类群在原位冷泉沉积物中的甲烷代谢机制和生态功能提供了基础。

本文引用格式

何茂雨 , 王景 , 李思翰 , 梁乐文 . 应用HCR-FISH技术研究冷泉沉积物中甲烷厌氧氧化古菌的生存状态[J]. 海洋学研究, 2025 , 43(1) : 22 -33 . DOI: 10.3969/j.issn.1001-909X.2025.01.003

Abstract

The anaerobic oxidation of methane (AOM) is a pivotal component of elemental cycling within cold seep sediments. This process is usually performed by anaerobic methanotrophic archaea (ANME) and sulfate-reducing bacteria (SRB), which usually exist as symbionts. However, pure cultures of ANME have not yet been obtained, and their slow metabolism hinders further exploration and research into their metabolic characteristics and collaborative mechanisms. In this study, we utilized hybridization chain reaction-fluorescence in situ hybridization (HCR-FISH) technology and high-throughput 16S rRNA gene sequencing to investigate the composition and state of ANME communities at different depths of the sediments in the black microbial mat area of the South China Sea Formosa cold seep. The results showed that ANME-1 and ANME-2 were the dominant groups in the sampled Formosa cold seep sediments. Specifically, ANME-2 was found to form consortia with SRB, while no such associations were detected for ANME-1. This observation suggested that ANME-2 and SRB primarily engage in symbiotic AOM processes, highlighting potential differences in physiological roles and methane metabolism pathways between ANME-1 and ANME-2. Furthermore, in sediment samples of all layers, the diameters of ANME-2/SRB consortia were predominantly concentrated between 3-10 μm. Correlation analysis indicated a significant link between the distribution of consortium diameters and environmental factors such as sulfate concentration in the sediment, underscoring the impact of environmental factors on the growth of ANME/SRB consortia. Additionally, using HCR-FISH, we further discovered the presence of multiple consortium clusters in the Formosa cold seep sediment, characterized by orderly connected and uniform-sized consortium, implying possible connections or cooperative relationships among consortia. This study revealed the presence and distribution patterns of ANME groups and sizes of symbiotic microbial consortia in sediment samples from different depths of the Formosa cold seep, laying the foundation for further understanding methane metabolism mechanisms and ecological functions of different ANME groups in situ cold seep sediments.

0 引言

海洋约占地球表面的70%,是地球上最大的微生物栖息地之一[1]。其中,冷泉作为海洋中的典型生境,自20世纪80年代被发现以来一直是研究的热点[2]。在冷泉环境中,富含甲烷及其他碳氢化合物的流体从沉积物深层向上迁移至海床,并最终进入上覆水体。冷泉被认为是沉积物中微生物介导元素循环的重要场所,这些丰富多样的微生物代谢活动也支撑、形成了独特的冷泉生态系统[3]。其中,甲烷厌氧氧化(anaerobic oxidation of methane,AOM)过程是冷泉生态系统中的主要生物地球化学循环过程之一,该过程消耗了大部分海洋沉积物中产生的甲烷,有效抑制了其向大气的排放[1]
AOM被认为主要由甲烷厌氧氧化古菌(anaerobic methanotrophic archaea,ANME)和硫酸盐还原细菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)共同完成,两者通常以共生体的方式存在[1]。根据KNITTEL等[1]对16S rRNA基因的系统发育分析,海洋环境中介导AOM的ANME被分为三个不同的分支,即ANME-1、ANME-2和ANME-3。ANME-2和ANME-3属于Methanosar-cinales目,其中,ANME-3与Methanococcoides属关系密切;而ANME-1与Methanosarcinales目和Methano-microbiales目关系较远,属于一个新的分支目。与ANME共生的SRB的常见类群属于Desulfosarcina/Desulfococcus属(DSS)和Desulfobulbaceae科,其中,DSS多与ANME形成不同形式的ANME/DSS细胞团[4]。由于参与AOM过程的ANME类群尚未获得纯培养菌株,且其代谢缓慢,人们对于ANME和SRB不同类群的代谢特征以及它们在AOM过程中的协同作用机制了解尚不充分。
荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridi-zation, FISH)是利用碱基互补配对的性质,将带有荧光的外源核酸作为探针,与微生物细胞中的DNA或RNA互补配对,形成核酸-荧光杂交分子,从而对沉积物中的微生物类群进行直接观察。值得注意的是,传统的FISH在信号强度和特异性方面通常更适用于高活性的微生物。在环境样品中,特别是海洋极端环境沉积物中的微生物,由于细胞内rRNA含量较低,荧光杂交信号较弱,限制了FISH技术对这些微生物的检测能力。催化报告沉积荧光原位杂交技术(catalysed reporter deposition-FISH,CARD-FISH)是提高FISH灵敏度的一种有效方法[5]。CARD-FISH使用的是辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的单一寡核苷酸探针,在HRP的催化作用下,携带荧光基团的酪胺分子被激活并与细胞结合,产生强烈且稳定的荧光信号,从而实现信号的放大[6]。然而,CARD-FISH也存在一些局限性。首先,与荧光染料相比,HRP的分子量较大(约40 kDa),而大多数荧光基团的分子量仅为500~800 Da。因此,探针的透过性很大程度上被探针体积和细胞通透性限制[7]。其次,由于细胞内天然存在过氧化物酶,必须先对其进行失活处理,以避免假阳性结果。这一步骤可能会对细胞内的RNA造成损伤,从而影响后续的杂交效果[8]
杂交链反应-荧光原位杂交(HCR-FISH)是杂交链反应(hybridization chain reaction,HCR)与传统FISH的结合应用。传统FISH探针上串联的HCR起始核酸序列可与携带荧光标记的扩增核酸探针特异性结合,并促使其开环。失去二级结构的扩增探针呈现相似的起始序列,从而反复引发该等温扩增过程,实现原位信号放大的效果。与CARD-FISH相比,HCR-FISH在微生物研究中展现出显著的优势。首先,CARD-FISH需要在应用前对样本中的内源性过氧化物酶进行灭活,而HCR-FISH不依赖于酶促反应,因此能够避免因使用过氧化氢和盐酸等化学试剂可能导致的目标细胞RNA损伤[9]。这一点不仅减少了对样本的潜在损害,也简化了实验步骤,节省了操作时间。其次,HCR-FISH使用的探针分子量远小于CARD-FISH中辣根过氧化物酶标记的探针分子量,这使得HCR-FISH探针更容易穿透细胞,从而保证了信号检测的灵敏性。最后,HCR-FISH允许通过更换起始探针来针对不同的目标微生物,可以使用多种探针对多个目标进行同时观察,无需对每个探针进行单独的灭活处理,这进一步减少了实验时间和成本。因此,HCR-FISH作为一种高效、简便的细胞检测技术,更适合于低rRNA含量的环境微生物样品研究。利用该技术能够更好地实现对极端环境沉积物中微生物状态的观察,揭示微生物间的相互作用关系。
利用FISH技术研究发现,不同的ANME类群具有形态差异,且ANME和共生细菌之间具有不同形式的关联。从ANME的形态来看,ANME-2和ANME-3类群古菌呈球形,而ANME-1类群古菌多呈杆状形态[10]。从ANME的存在状态来看,ANME-1通常以单细胞或2~4个细胞形成的链条等形式出现。此外,也观察到ANME-1细胞可以形成长度超过100 μm的长细胞链[1]。而ANME-2和ANME-3类群多与SRB类群形成细胞团聚物,最常见的是与SRB形成的壳型结构[11]
尽管先前的研究揭示了ANME和共生细菌之间不同形式的关联,但研究中使用的样品多为经过实验室长期培养后的富集物[12]。与原位环境样品相比,经过人工富集培养的微生物的存在状态可能会发生改变。前期研究显示,冷泉环境中的主导微生物类群通常包括进行甲烷厌氧氧化的ANME和进行硫酸盐还原的SRB。在冷泉沉积物中,甲烷、硫酸盐浓度等理化参数以及AOM的速率会随着沉积物深度的变化而发生改变,主导的ANME和细菌类群也会有所不同[13-15]。因此,ANME和共生细菌之间的关联在环境样品中可能也会有相应的变化。
为了探索冷泉沉积物中ANME类群和共生细菌的共生方式、形态等对环境因子的响应,并进一步揭示ANME的甲烷代谢机制和生态特征,本研究选取了Formosa冷泉(简称F冷泉)区域AOM过程活跃的沉积物样品,利用HCR-FISH技术,并结合前期对于F冷泉沉积物16S rRNA基因高通量测序和定量的结果[15],对其中ANME和共生细菌的组成和形态特征进行了综合研究。

1 材料与方法

1.1 样本的采集和固定

沉积物样品于2020年5月—6月采集自台西南盆地F冷泉区域的黑色菌席区,在该菌席区可观察到明显的甲烷气泡冒出,且样品具有刺激性气味(硫化氢气体挥发)。采集的沉积物样品为插管柱状沉积物样品,由“科学”号科考船搭载的“发现”号 ROV采集。本文选用D231站位的6根柱状沉积物样品用于后续研究,样品信息见表1。用于后续16S rRNA基因测序样本的保存方法参照本研究团队已发表的文献[15]所述步骤进行。选取位于黑色菌席区中心的D231-4沉积物样品用于后续的HCR-FISH实验。将柱状沉积物样品回收到甲板后,按2 cm一层进行分样,样品的地球化学参数和微生物丰度等信息已进行过测定[15]。从该沉积物表层到深层等梯度选取5个层位,分别为0~2 cm,4~6 cm,8~10 cm,12~14 cm以及16~18 cm,用于后续的HCR-FISH实验观察。在船上的实验室内,补充NaCl至海水相同渗透压,将上述样品在4 ℃下按照1∶4(w/v)的比例加入4%(w/v)多聚甲醛溶液固定6 h。在固定完成的样品中加入两倍体积的1×PBS缓冲液清洗两遍,12 000 g离心10 min,弃去上清液,加入与样品等体积的1×PBS缓冲液重悬后可用于下一步的细胞分离;加入与样品等体积的1×PBS缓冲液∶乙醇为1∶1(v/v)的混合物重悬,于-20 ℃中保存[16]
表1 本研究中采用的Formosa冷泉沉积物样本信息

Tab.1 Information of sediment samples in Formosa cold seep used in this study

样品
编号
沉积物描述 沉积物柱状
样深度/cm
样品数
量/个
D231-1 还原性沉积物外部对照 14 7
D231-2 还原性沉积物上边缘交界 30 15
D231-3 还原性沉积物中心1 20 10
D231-4 还原性沉积物中心2 18 9
D231-5 还原性沉积物中心下边缘交界 22 11
D231-6 还原性沉积物白色菌席 18 9
合计 61

1.2 沉积物样品16S rRNA基因测序和分析

本研究参照文献[15]对F冷泉区D231站位的6根柱状沉积物样品进行DNA提取和测序,其中,D231-4沉积物样品的16S rRNA基因测序数据源自先前对F冷泉区微生物多样性的调查研究[15]。测序得到的数据使用QIIME2(2021.4)[17]进行分析。首先,对测序文件进行拆分(demultiplexing),并去除非生物序列(barcode、adapter以及引物片段)。然后使用QIIME2中的DADA2插件去除测序序列中的噪声和嵌合体片段,得到以扩增子序列变体(amplicon sequence variants,ASV)作为分析单元的特征表及其代表序列。将61个样品的序列数按最小序列数(51 696条)进行归一化处理。。使用SILVA 16S rRNA基因数据库[18](版本138)对ASV进行物种信息注释,而后对序列进行过滤,分别得到细菌和古菌的序列,计算它们的相对丰度,并绘制物种组成的柱状图。筛选沉积物样品中相对丰度超过1%的ANME和SRB的ASV,使用R软件(版本4.2.1)的“corrplot”程序包[19]计算Pearson相关性系数,并利用“pheatmap”程序包[20]来完成相关的热图绘制。

1.3 D231-4沉积物样品HCR-FISH流程

1.3.1 细胞分离

处理后的样品作为重悬液,按照重悬液∶细胞洗脱液(100 mmol/L EDTA,100 mmol/L sodium pyrophosphate,1%(v/v)Tween 80)= 8∶1的比例加入相应体积的细胞洗脱液,在涡旋震荡仪(Vortex-Genie 2, Scientific Industries)上使用5档震荡1 h。

1.3.2 细胞提取

使用30%、50%、80%(w/v)的Nycodenz溶液制备多层密度梯度离心管,将上一步骤中震荡完的样品混合均匀,轻轻加至多层密度梯度离心管的液面上方,1 500 g离心30 min。离心完成后将上层液体转移至干净离心管内,使用减压抽滤系统将细胞过滤到0.22 μm孔径的聚碳酸酯滤膜上。

1.3.3 HCR-FISH流程

研究中用到的起始探针和扩增探针的序列信息见表2。该实验流程基于传统的HCR-FISH方案[9]并根据样品进行了相应的调整[16]。流程如下:剪取1/8片过滤完样品的滤膜,将其置于十二孔板中空腔的中央,加入20 μL杂交液,使用封板膜密封十二孔板,在46 ℃恒温箱中孵育2 h。将清洗液在48 ℃预热后加入滤膜所在孔板腔内,在48 ℃恒温箱内浸洗30 min。随后,将浸洗后的滤膜转移至干净空腔内,干燥。在干燥后的滤膜上加入20 μL混合后的扩增液,35 ℃恒温箱内孵育20 min。
表2 本研究中使用的HCR-FISH探针序列

Tab.2 HCR-FISH probes used in this study

探针名称 靶向类群 探针序列(5’-3’) 来源
起始
探针
ARCH915-H Archaea CCGAATACAAAGCATCAACGACTAGAAAAAAGTGCTCCCCCGCCAATTCCT 文献[8]
EUB338-R Bacteria TACGCCCTAAGAATCCGAACCCTATGAAATAGCTGCCTCCCGTAGGAGT 文献[16]
ANME-1-350-H ANME-1 CCGAATACAAAGCATCAACGACTAGAAAAAAAGTTTTCGCGCCTGATGC 文献[16]
ANME-2-538-H ANME-2 CCGAATACAAAGCATCAACGACTAGAAAAAAGGCTACCACTCGGGCCGC 本研究
ANME-3-1249-H ANME-3 CCGAATACAAAGCATCAACGACTAGAAAAAATCGGAGTAGGGACCCATT 本研究
DSS658-R Desulfosarcina-Desulfococcus TACGCCCTAAGAATCCGAACCCTATGAAATATCCACTTCCCTCTCCCAT 本研究
扩增
探针
H1 CATAGGGTTCGGATTCTTAGGGCGTAGCAGCATCAATACGCCCTAAGAATCC 文献[21]
H2 TACGCCCTAAGAATCCGAACCCTATGGGATTCTTAGGGCGTATTGATGCTGC 文献[21]
R1 TCTAGTCGTTGATGCTTTGTATTCGGCGACAGATAACCGAATACAAAGCATC 文献[21]
R2 CCGAATACAAAGCATCAACGACTAGAGATGCTTTGTATTCGGTTATCTGTCG 文献[21]
本次使用的杂交液和扩增液中,根据实验的实际情况对使用的起始探针和扩增探针浓度进行了相应的调整。其中,杂交液包含了20 mmol/L Tris-HCl,250 mmol/L EDTA,0.01%(w/v)SDS,25% (v/v) 甲酰胺以及浓度为2.5 μmol/L的起始探针。清洗液包含20 mmol/L Tris-HCl,0.01% (w/v) SDS和0.159 mol/L NaCl。扩增液中包含溶于扩增缓冲液中浓度为5 μmol/L的扩增探针,扩增缓冲液包含20 mmol/L Tris-HCl,0.01% (w/v) SDS和0.159 mol/L NaCl。在制备扩增液时,扩增探针需要分别稀释于扩增缓冲液中,在95 ℃加热90 s,再降温至25 ℃保持30 min,混合,得到扩增探针的浓度为5 μmol/L的扩增液。

1.3.4 DAPI复染及制片观察

扩增反应结束后,在放置滤膜的十二孔板的腔内加入10 mL 1×PBS缓冲液浸洗滤膜,置于冰上10 min。换十二孔板空腔放置滤膜,干燥后向滤膜表面滴加20 μL 10 ng/mL DAPI,室温放置10 min,用于对照染色。最后加入10 mL 1×PBS缓冲液浸洗滤膜10 min,取出滤膜风干,滴加50%甘油制片并进行显微观察。使用高速高灵敏度激光共聚焦显微镜(IXplore SpinSR,Olympus)进行观察,并使用cellSens Dimension图像软件进行图像采集,曝光时间根据信号强度在50~800 ms之间。使用405 nm的激光器激发 DAPI,使用488 nm的激光器激发Alexa Fluor 488,使用594 nm的激光器激发Alexa Fluor 594。

2 结果与分析

2.1 ANME和SRB的组成及相关性分析

本研究所选用的D231-4沉积物样品中,不同深度的ANME和SRB类群相对丰度如图1a图1b所示。古菌类群主要由甲烷厌氧氧化古菌组成,包括:ANME-1b、ANME-2a-2b、ANME-2c和ANME-3。在表层沉积物中,ANME-2a-2b和ANME-2c是主要类群,分别占古菌类群的37%和23%,ANME-1b仅占4%。随着深度的增加,ANME-1b相对丰度在12~14 cm可达古菌类群的一半以上(52%),取代ANME-2的主导地位,成为深层沉积物中的古菌优势类群(图1a)。
图1 Formosa冷泉沉积物样本中ANME和SRB类群的组成及相关性

(图a表示D231-4站位中ANME类群随深度的变化,图中的“Others”表示除ANME以外的古菌和ASV小于1%的ANME;图b表示D231-4站位中SRB类群随深度的变化,图中的“Others”表示除SRB以外的细菌和ASV小于1%的SRB;图c表示D231站位所有层位样本中ANME和SRB类群的Pearson相关性热图,共使用61个沉积物样品,*表示p<0.05,**表示p<0.01。)

Fig.1 Composition and correlation of ANME and SRB groups in the sediment samples of Formosa cold seep

(Figure a illustrates the variation of ANME groups with depth in site D231-4, where “Others” in the figure represents archaea other than ANME and ANME with ASV abundances less than 1%. Figure b depicts the variation of SRB groups with depth in site D231-4, where “Others” denotes bacteria other than SRB and SRB with ASV abundances less than 1%. Figure c presents a Pearson correlation heatmap of ANME and SRB groups across all depth intervals from station D231, based on 61 sediment samples. In the heatmap, * indicates p<0.05, and ** indicates p<0.01.)

先前的研究显示,在F冷泉区沉积物站位中细菌类群相对丰度较高的是参与硫酸盐还原过程的硫还原杆菌(Desulfobacterota)和参与硫氧化过程的弯曲菌(Campylobacteria),两者分别占细菌总丰度的20.2%和12.8%[15]。对于本研究关注的D231-4样品,硫还原杆菌中的SEEP-SRB1是最主要的SRB类群,其相对丰度占细菌总丰度的8%~23%;其次是SEEP-SRB2,该类群主要分布在沉积物的下层,其相对丰度占细菌总丰度的1%~10%;此外,Desulfatiglans在细菌中也有较高的比例,占细菌总丰度的2%~6%(图1b)。
为了更好地理解D231站位样品中ANME和SRB之间的耦合关系,我们对其中相对丰度超过1%的ANME和SRB进行了Pearson相关性分析。结果显示,ANME-2c(p<0.01)、ANME-2a-2b(p<0.05)以及ANME-3(p<0.05)都与SEEP-SRB1呈正相关,ANME-1b与Desulfatiglans(p<0.05)和SEEP-SRB2(p<0.01)呈正相关,ANME-1a与SRB类群无明显相关性(图1c)。

2.2 菌团组成及形态

首先,为了尽可能地发现沉积物中不同菌团存在的形态,使用古菌和细菌的通用探针——ARCH915-H/EUB338-R探针组来与不同层位的沉积物中的古菌和细菌16S rRNA基因的特异性序列进行杂交,并通过荧光显微镜观察其形态。结果显示,不同层位中古菌和细菌形成的菌团均为壳型结构,即古菌聚集在一起形成球状的内部核心,细菌在外围形成壳将其紧紧地包围(图2a、2b),除此之外,未发现其他类型的菌团聚集体。
图2 Formosa冷泉样本中ANME-SRB菌团的HCR-FISH图像

(图a显示了由古菌和细菌组成的菌团;图b显示了由ANME-2和SRB组成的ANME-SRB菌团;与DSS探针阳性杂交的ANME-SRB菌团中未观察到与靶向ANME-1(图c)或ANME-3(图d)的探针杂交信号。采用寡核苷酸探针DSS658-R和EUB338-R分别靶向SRB类群和细菌,标记为红色;探针ARCH915-H、ANME-1-350-H、ANME-2-538-H和ANME-3-1249-H分别靶向古菌、ANME-1、ANME-2和ANME-3,标记为绿色;DAPI复染用于细胞核染色,显示为蓝色。)

Fig.2 HCR-FISH images of ANME-SRB consortia in the sediment samples of Formosa cold seep

(Figure a illustrates microbial consortia composed of archaea and bacteria. Figure b displays ANME-SRB consortia consisting of ANME-2 and sulfate-reducing bacteria (SRB). No hybridization signals were observed for ANME-SRB consortia that were positively hybridized with the DSS probe when probed with ANME-1-targeting (Figure c) or ANME-3-targeting (Figure d) probes. Oligonucleotide probes DSS658-R and EUB338-R were employed to target SRB and bacteria, respectively, and were labeled red. Probes ARCH915-H, ANME-1-350-H, ANME-2-538-H, and ANME-3-1249-H were used to target archaea, ANME-1, ANME-2, and ANME-3, respectively, and were labeled green. DAPI staining was applied for nuclear staining and appeared blue.)

接着,每个层位的沉积物样品分别与ANME-1-350-H/DSS658-R探针组、ANME-2-538-H/DSS658-R探针组和ANME-3-1249-H/DSS658-R探针组进行HCR-FISH杂交,并用DAPI进行对照染色,在荧光显微镜下确定菌团的组成情况。每个层位样品与3个不同探针组杂交后,各计数100个染色菌团,观察不同探针组的杂交情况。表3是各层位菌团中观察到的不同ANME类群的细胞团数量。
表3 不同深度沉积物中观察到的ANME细胞团数量

Tab.3 The ANME consortia number observed in the sediments at different depths

层位 细胞团数量/个
ANME-1 ANME-2 ANME-3
0~2 cm 0 86 0
4~6 cm 0 71 0
8~10 cm 0 73 0
12~14 cm 0 82 0
16~18 cm 0 78 0
平均 0 78 0
根据荧光图像显示,在使用ANME-2-538-H/DSS658-R探针组进行杂交的实验组中,不同层位沉积物样品的染色菌团中均可以观察到清晰的ANME-2和SRB细胞的荧光信号,两者形成壳型的微生物聚集体(图2b)。平均每100个染色菌团中,有78个菌团可以观察到ANME-2的存在。在少量染色菌团中仅观察到SRB存在的荧光信号,而没有观察到相应的ANME-2的荧光信号。此外,存在10%左右的菌团仅被DAPI染色,而观察不到相应的ANME或SRB的荧光信号。而在使用ANME-1-350-H/DSS658-R探针组和ANME-3-1249-H/DSS658-R探针组进行杂交的实验组中,均未能够在染色的菌团中观察到ANME-1细胞或ANME-3细胞的荧光信号,大多数染色菌团中,只能观察到菌团外层SRB的荧光信号(图2c、2d)。

2.3 不同深度下菌团的大小变化及与环境因子的相关性

在荧光显微镜下观察并测量沉积物样品中ANME-2/DSS菌团直径的大小,每个层位样品计数100个菌团。根据以往的沉积物研究,ANME和SRB形成菌团的平均直径为3~5 μm[1],且鉴于本研究中的菌团在3~10 μm的直径范围内均匀集中分布,而在0~3 μm和大于10 μm的直径范围内菌团数量极少,因此将观察到的菌团直径划分为4个范围,分别为0~3 μm、3~5 μm、5~10 μm以及>10 μm,并绘制了各层位菌团大小组成的柱状图(图3)。
图3 Formosa冷泉样本中菌团大小的组成情况

Fig.3 The composition of the consortia size in the sediment samples of Formosa cold seep

在所有层位的沉积物样品中,菌团直径均集中在3~10 μm之间,极个别的菌团直径在0~3 μm和>10 μm的范围。其中,直径为3~5 μm的菌团占主导地位,可达菌团总数的80%以上(图3)。在沉积物样品的表层和次表层,主要以直径为3~5 μm的菌团为主,其次是直径为5~10 μm的菌团,两者比例约为4∶1(图3)。随着深度的增加,沉积物样品中直径为3~5 μm的菌团相对数量逐渐减少,直径为5~10 μm的菌团相对数量逐渐增加,两者数量比接近1∶1(图3)。
为了探究环境因子如甲烷、硫酸盐等对菌团形成大小可能造成的影响,将不同层位的环境参数——甲烷浓度、硫酸盐浓度、硫化氢浓度及溶解性无机碳(dissolved inorganic carbon,DIC)浓度与不同直径菌团的相对数量进行了相关性分析。根据图4可知,硫酸盐、硫化氢以及DIC等环境因子的浓度与不同直径菌团的相对数量之间存在较高的相关性。硫酸盐浓度与直径为3~5 μm的菌团相对数量呈显著正相关(p<0.05),而与直径为5~10 μm的菌团相对数量呈显著负相关(p<0.05)。硫化氢浓度和DIC浓度与直径为0~3 μm的菌团相对数量呈显著负相关(p<0.05)。
图4 环境因子与菌团大小之间的Pearson相关系数热图

Fig.4 Heatmap of Pearson’s correlation coefficients between environmental factors and consortia sizes

2.4 菌团聚集体

在实验中,还发现了一些特殊形态的细胞团。在12~14 cm层位的沉积物样品中,观察到4个关联的菌团(图5a),对其使用共聚焦显微镜进行了z轴上的层扫,观察其立体结构。出乎意料的是,在4个排列整齐的菌团上面,还存在第5个菌团(图5b、5c)。由于该5联菌团排列整齐,推测其在沉积物中便形成了此种联系,而不是由于过滤等前处理步骤人为导致的。
图5 菌团簇的HCR-FISH图像

(菌团与靶向SRB的探针(DSS658-R)阳性杂交,显示为红色; DAPI显示为蓝色。从图a到图c是来自不同z轴的扫描结果。)

Fig.5 The HCR-FISH images of the consortia cluster

(The microbial consortia exhibited positive hybridization with the SRB-targeting probe (DSS658-R, red), DAPI staining appeared blue. Figures a to c represent scanning results from different z-axes.)

3 讨论

3.1 冷泉区不同深度沉积物中菌团的组成和形态

用16S rRNA基因进行测序,与数据库已有序列进行比对,可以确定微生物的群落组成和相对丰度等信息[22]。但该方法并不能提供关于微生物的形态、空间分布或不同类群之间形成的物理联系等信息[23]。HCR-FISH可以根据目标微生物设计相应的探针并使用荧光物质进行标记,探针与目标微生物细胞中相应的RNA结合,从而实现对微生物生存状态及形态的直接观察[9]。结合基于荧光的HCR-FISH可以直接确认微生物的形态以及不同微生物类群之间的物理关联,有助于表征微生物关系的特异性[4,24-25]。前期研究通过FISH在荧光显微镜下观察到了ANME和SRB的聚集体,初步揭示了ANME和SRB的共生关系[25]。自此以来,在冷泉中也经常发现ANME和共生细菌之间不同形式的关联[1,11,26]。以往研究表明,ANME-1类群经常以单细胞的形式存在[4,11,27],而ANME-2类群倾向于和SRB共生形成细胞聚集体[4],ANME-3被发现可以与SRB形成细胞菌团,也被发现单独存在[28]
前期对冷泉沉积物中16S rRNA基因测序结果[15]显示,在本研究所选站点沉积物中ANME-1b、ANME-2a-2b和ANME-2c是主要ANME亚群。在硫酸盐丰富的沉积物上层,ANME-2a-2b和ANME-2c是古菌的优势类群,随着深度增加,ANME-1b 类群的相对丰度不断增加,在底层沉积物中可占古菌丰度的一半以上。ANME-1类群在缺乏硫酸盐的沉积物底层富集被认为是能够在硫酸盐耗尽的环境单独进行AOM过程[13,28-29],或进行产甲烷过程[30]。细菌中,SRB是冷泉生境内的最主要类群,占细菌总体相对丰度的20%以上。该类群在冷泉沉积物中通常与ANME形成共生体来共同完成AOM过程[1],且其相对丰度与硫酸盐浓度呈显著正相关[13,31]
通过对ANME和SRB的相关性分析发现,ANME-2c(p<0.01),ANME-2a-2b(p<0.05)以及ANME-3(p<0.05)都与SEEP-SRB1呈正相关,ANME-1b与Desulfatiglans(p<0.05)和SEEP-SRB2(p<0.01)呈正相关(图1c),这表示不同的ANME和相关的SRB类群可能在沉积物中进行合作,共同完成AOM过程。在之前的研究中[32],也在ANME和SRB的相关性分析中发现了ANME-1和SEEP-SRB2的显著正相关。据此,先前研究推测ANME-1和SEEP-SRB2可能在冷泉沉积物中形成了AOM聚集体[32]
鉴于不同ANME和SRB的相关性,本研究设计了相应的ANME和SRB探针,利用HCR-FISH观察了南海F冷泉黑色菌席区中心D231-4站位不同深度沉积物样品中微生物的存在状态,分析了菌团组成以及共生关系。尽管对16S rRNA基因的分析显示ANME-1和SEEP-SRB2存在显著的正相关关系,但通过HCR-FISH对各个层位样品的观察,未能在细胞聚集体中发现ANME-1类群的存在。而对ANME-2亚群(ANME-2a-2b、ANME-2c)的观察结果与相关性分析相一致,在各个层位观察到的菌团主要由ANME-2和SRB组成,且未观察到明显的ANME-2单细胞。此外,未在菌团中观察到ANME-3的存在,原因可能是其未参与菌团的组成,也可能是其在沉积物样品中含量较少而观察不到。是否成团也反映了 AOM过程中ANME和SRB的合作机制。本研究中,未在菌团中观察到ANME-1的存在,很可能是由于ANME-1能够独立进行厌氧甲烷氧化,这符合ANME-1具有单独完成AOM过程的能力的假说[13,28-29],或ANME-1与相关的SRB类群之间以不同于成团的方式进行合作。同时也暗示ANME-1与ANME-2在甲烷代谢过程中的生理功能和代谢能力不同[13,28,33-34]。此外,深海沉积物中的微生物细胞及其菌团结构在采样和转运过程中可能会受到多种环境因素的影响,包括压力、氧气浓度、温度等。比如压力变化,当沉积物样品被带到海面时,压力的显著降低可能会破坏细胞结构,会改变菌团的结构和组成,影响微生物的代谢活动,甚至导致细胞死亡。虽然本研究所使用的样品在采集后立即在甲板上进行细胞固定,尽可能地降低这些环境因素带来的影响,但不能完全排除上述环境变化的潜在影响。因此,后续仍需进一步发展原位观测技术,对其原位特征进行直接观测。

3.2 冷泉沉积物中菌团的大小变化

聚集成团的细胞紧密接触,进行细胞间的代谢耦联,从而可以适应对其不利的栖息环境。
不同数量的ANME与SRB细胞形成的菌团大小不同,菌团中的细胞数量与其完成AOM的速率存在一定相关性[25]。在原位环境沉积物中很少发现直径> 20 μm的菌团[1],而在富集培养的沉积物中,菌团的直径最大可达到50 μm[12],这表明菌团大小或ANME/SRB的生存状态可能受环境条件的影响。因此,在原位环境沉积物中,两者协同完成AOM过程可能会存在一个细胞数量或菌团大小的范围限制,使其能够更好地在原位极端环境中生存。
对沉积物样品中菌团直径的统计结果表明,菌团直径集中在3~10 μm之间,极个别菌团直径在0~3 μm或>10 μm的范围,其中,直径为3~5 μm的菌团占主导地位,可达菌团总数的80%以上(图3)。推测直径为3~10 μm的菌团,其所占据的空间范围,或者所包含的ANME和SRB的细胞数量,更利于在原位环境沉积物中ANME和SRB的协作共生。
由于环境条件的限制,原位环境沉积物和富集培养沉积物中菌团分裂的临界尺寸也有很大的不同。ANME-2/SRB形成的菌团会从几个ANME和SRB细胞开始,逐渐增大,当SRB生长到菌团核心时,较大的菌团均匀地分裂成两个聚集体,或不均匀地分裂成更多的聚集体[12]。在本研究中的南海F冷泉原位环境沉积物中,菌团直径集中在3~10 μm,极个别菌团直径>10 μm,推测在该冷泉环境中ANME和SRB菌团分裂的临界尺寸在10 μm左右。因此,细胞聚集体的大小或许可以作为一个指标用于评估原位环境沉积物中的AOM过程及ANME-SRB相互作用特征,有必要在未来的研究中进一步进行探索和验证。

3.3 环境因子与菌团大小的相关性

在冷泉区的不同生境中,各种环境理化参数有着很大的变化,相应的ANME和SRB类群组成、共生方式及AOM代谢过程可能也存在着显著的差异[13-15,35]。例如ANME-1的分布与沉积物深度和温度相关,ANME-2a-2b 主要分布于富含硫酸盐的沉积物中,ANME-2c 多存在于高甲烷环境的沉积物中[14]。而SRB类群的相对丰度则与硫酸盐浓度显著相关[31]
ANME和SRB在沉积物中通常以形成菌团的形式,共同完成AOM过程[36-38]。通过环境因子与菌团大小的相关性分析发现,硫酸盐浓度与直径为3~5 μm的菌团相对数量呈显著正相关(p<0.05),与直径为5~10 μm的菌团相对数量呈显著负相关(p<0.05)。推测在表层沉积物中,虽然硫酸盐浓度较高,但AOM速率较低,菌团的生长比较缓慢,故直径为3~5 μm的菌团数量比例较高;而在AOM过程活跃、硫酸盐浓度较低的次表层沉积物中(如硫酸盐-甲烷转换带10 cm附近),菌团的生长加快,故直径为3~5 μm的菌团相对数量逐渐减少,直径为5~10 μm的菌团数量比例增加。这同样印证了ANME和SRB形成的菌团尺寸可能是反映环境中ANME-SRB相互作用关系和代谢特征的重要指标,并且进一步反映出原位环境条件可能会直接或间接地对菌团的生长、分裂产生影响。

3.4 菌团聚集体的形成

使用共聚焦显微镜对杂交样品进行z轴层扫的过程中发现了5个在立体空间排列整齐、大小均匀的菌团形成的菌团簇。根据其排列整齐程度和空间结构关系,排除了由于过滤等前处理步骤人为导致的可能性。尽管未使用古菌探针观察到荧光信号,但基于SRB探针的强阳性反应(图5)、菌团的典型壳型结构[10-11,26]、该层位ANME类群的高丰度(图1a)以及其与SRB的显著正相关性(图1c),推测该聚集体可能为ANME/SRB共生体。前期在富集培养物的研究中发现,ANME-2/SRB形成的典型壳型菌团会从几个ANME和SRB细胞开始,逐渐增大,经过进一步生长,菌团形成“芽”和裂缝,此时共生细菌会沿着缝隙逐步向菌团内部繁殖。当SRB生长到古菌核心时,ANME/SRB形成的较大菌团会进行分裂,均匀地分裂成两个聚集体,或不均匀地分裂成更多的聚集体[12]。因此,推测在F冷泉原位沉积物中,ANME/SRB细胞形成菌团后,一些菌团间可能仍会以特殊排列结构相互联系,这种菌团连接方式或有助于促进菌团间的合作。同时,这也表明AOM共生体在原位环境中可能存在更为复杂和多样化的成团或协作机制[35],有待进一步的深入研究。

4 结论

本研究通过基于荧光的HCR-FISH技术结合16S rRNA基因高通量测序结果,调查了南海F冷泉黑色菌席区不同深度的沉积物中ANME和SRB等微生物群落组成情况以及存在状态,探究了不同深度沉积物中的菌团组成以及大小变化规律。
ANME和SRB的相关性分析结果显示,ANME-1和SEEP-SRB2存在显著的正相关关系,ANME-2与SEEP-SRB1存在显著的正相关关系。通过HCR-FISH仅发现ANME-2和SRB的细胞团,而未观察到ANME-1细胞团,指示不同ANME类群在甲烷生成和氧化方面的生理功能和代谢能力不同。而传统的基于测序数据的关联分析可能无法完全准确反映环境中的微生物相互作用关系。此外,F冷泉沉积物中ANME/SRB菌团的大小受到环境条件的影响和限制。沉积物样品中菌团直径集中在3~10 μm,其中,直径为3~5 μm的菌团占主导地位,可达菌团总数的80%以上。推测直径为3~10 μm的菌团,其空间范围或所包含的ANME和SRB的细胞数量,更利于原位环境沉积物中ANME和SRB的协作共生。环境因子与菌团大小的相关性分析显示,硫酸盐浓度与菌团大小的变化关系显著。硫酸盐浓度与直径为3~5 μm的菌团相对数量呈显著正相关(p<0.05),与直径为5~10 μm的菌团相对数量呈显著负相关(p<0.05)。硫酸盐可能是通过影响AOM速率、ANME和SRB类群的分布,直接或间接地对菌团的特征产生了影响。此外,空间对称的5联菌团簇可能是菌团间合作的一种联系,暗示ANME/SRB在原位环境中成团或协作机制复杂多样,有待进一步的深入研究。
本研究通过HCR-FISH技术对ANME在F冷泉沉积物中的存在状态以及在不同深度沉积物中形成菌团的大小等特点进行探索,揭示了F冷泉沉积物中ANME及其共生细菌所形成细胞团的特征和影响因素,有效验证和补充了前期基于16S rRNA基因测序数据得到的研究结果,为进一步深入理解原位沉积物中ANME介导的AOM过程及ANME/SRB共生菌团的生态特征提供了基础。

衷心感谢上海交通大学王风平教授对本研究的支持和帮助以及德国亥姆霍兹波茨坦地球科学研究中心的贾泽宇和上海交通大学董怡静对文章内容提供的宝贵建议。同时,感谢2020年“科学号”科考船南海冷泉综合航次全体工作人员、南方海洋科学与工程广东省实验室(珠海)牛明杨研究员和上海交通大学孙瑜对样品采集的协助。

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